結(jié)果和討論

表面壓縮性和酶活性。 純DMPA和混合DSAP/DMPA單層的表面壓力分子面積等溫線如圖1所示，與先前的結(jié)果一致。20,40對(duì)于純DMPA單層，每個(gè)分子在55和44?2之間存在一個(gè)典型的平臺(tái)，對(duì)應(yīng)于液體膨脹（LE）和液體冷凝（LC）相的共存區(qū)， 而LE-LC轉(zhuǎn)變發(fā)生在8.0mn/m。 與此相反，DSAP/DMPA混合單分子膜不存在共存區(qū)，液相膨脹相保持，直到表面壓力達(dá)到20 mN/m以下。

圖1.朗繆爾單分子膜的表面壓力-面積曲線：純DMPA（O）和DSAP/DMPA（1:3500，mol:mol）（4）。 曲線中顯示的斷點(diǎn)與混合單層的LE-LC轉(zhuǎn)變有關(guān)。

值得注意的是，為了避免不可逆的酶聚集，蛋白質(zhì)被分散在預(yù)成型的DMPA單分子膜上，而不是注入亞相。 此外，溶解酶儲(chǔ)備溶液中的C12（EO）9 0.01%在擴(kuò)散后進(jìn)一步稀釋，這無疑有利于酶在界面上的位置，我們可以將此過程確定為“無表面活性劑酶的表面滲透”。 這一過程是實(shí)驗(yàn)條件的結(jié)果，因?yàn)樵趤喯嘀袑⒈砻婊钚詣┫♂屩?0-6%（或0.21μmol/L）會(huì)使系統(tǒng)進(jìn)一步低于堿性磷酸酶/C12（EO）9（3.6μmol/L20,22）混合系統(tǒng)的臨界聚集濃度（CAC）42。 事實(shí)上，表面活性劑的稀釋已被用作誘導(dǎo)GPI錨定蛋白質(zhì)分子層吸附的成功方法。22,27此外，先前的數(shù)據(jù)20,22表明，向體積濃度為0.21μM的純水中添加C12（EO）9不會(huì)引起表面張力的變化， 既不適用于清潔空氣/水界面，也不適用于DMPA單層。

與酶表面沉淀過程相關(guān)的疏水性錨定物的存在強(qiáng)烈表明，酶的總擴(kuò)散量應(yīng)保持在與磷脂形成混合單層的空氣/液體界面，而底物（PNPP）及其水解產(chǎn)物（對(duì)硝基苯酚和無機(jī)磷酸鹽） 應(yīng)保持在子階段。 這與一些關(guān)于脂肪酶催化活性的報(bào)告43-48大不相同。 在這些研究中，酶被注射到亞相，在吸附到界面后，它會(huì)對(duì)該界面上的脂質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾。 相比之下，在目前的研究中，脂質(zhì)單層充當(dāng)酶的基質(zhì)，并且在化學(xué)上不受影響。 此外，在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中未觀察到PNPP水解：在側(cè)隔室中未檢測(cè)到吸光度或活性，這意味著酶在亞相中未溶解。 另一方面，在存在混合單層的中央腔室中檢測(cè)到催化活性。 這一結(jié)果明確地表明，在所采用的實(shí)驗(yàn)條件下，酶沒有分散在亞相中，而是完全吸附在氣液界面上。 還估計(jì)了在無酶的情況下PNPP的自發(fā)水解，考慮到實(shí)驗(yàn)所用的時(shí)間間隔，可以忽略。

在5到18 mN/m的表面壓力下，DMPA的表面密度從1.45×1017分子/m2變化到2.30×1017分子/m2。 考慮到DMPA和DSAP都保留在界面上，單層的壓縮應(yīng)減少磷脂和蛋白質(zhì)的可用面積。 因此，可以估計(jì)酶的表面密度，并將其與酶活性關(guān)聯(lián)起來（圖2）。 高達(dá)12.1 ng/cm2（對(duì)應(yīng)于18 mN/m的表面壓力）時(shí)，觀察到線性相關(guān)性，表明活性的增加直接反映了酶表面密度的增加。 然而，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)表面密度高于12.1 ng/cm2時(shí)，酶活性會(huì)突然下降。

圖3顯示了表面壓力對(duì)表面壓縮模量Cs-1的影響（定義49為表面壓縮性的倒數(shù)：Cs-1）[-A(?π/?A） ]T），以及DMPA朗繆爾單層中DSAP的酶活性。表面壓縮模量在圖3中是首選的，因?yàn)樗S著表面堆積而增加，并且也可以與單層的狀態(tài)相關(guān)。液體冷凝膜的Cs-1值通常高于50 mN/m。事實(shí)上，曲線中的斷點(diǎn)（在圖1中19（1 mN/m）處觀察到）伴隨著壓縮模量的突然增加（對(duì)于可忽略的面積/表面壓力變化，從55 mN/m到62 mN/m）此外，隨著表面壓力的增加，單層膜上的酶活性增加至均勻介質(zhì)中酶活性的91%，直到18 mN/m。盡管酶活性始終低于溶液中測(cè)得的酶活性，但與表面壓力無關(guān)，最大值與先前的報(bào)告21-23,50形成對(duì)比固定在固體載體上的堿性磷酸酶的酶活性，其在均相介質(zhì)中的活性范圍為10%至45%。事實(shí)上，這些研究中從未使用過低于20 mN/m的表面壓力，因?yàn)閱螌拥母邏嚎s性阻礙了其向固體載體的轉(zhuǎn)移。

此外，一些研究51揭示了Na+/K+-ATP酶活性與周圍膜脂的堆積之間的強(qiáng)烈相關(guān)性，盡管膜組成也表現(xiàn)出顯著的影響。

在空氣/液體界面觀察到的DSAP的最大活性發(fā)生在18 mN/m的表面壓力下（圖3）。如表面壓縮模量Cs-1的增加所示，酶活性在該值以上突然下降，單層壓縮性也隨之下降。這一結(jié)果可以解釋圖2中觀察到的表面密度高于12.1 ng/cm2時(shí)酶活性急劇下降的原因。通過對(duì)比分析壓縮模量與表面密度相比，壓縮模量的顯著增加（與單層的表面堆積有關(guān)）成為影響酶活性的主要因素，超過18 mN/m。值得注意的是，與在35-165 mN/m范圍內(nèi)觀察到的Cs-1的顯著變化無關(guān)（π在19和30 mN/m之間），酶活性幾乎保持不變，在均勻培養(yǎng)基中約為活性的50%。這一結(jié)果與報(bào)道的在30 mN/m表面壓力下轉(zhuǎn)移的DMPA/DSAP混合單層23 LB膜的43%活性密切相關(guān)，盡管蛋白質(zhì)表面密度顯著較高（179 ng/cm2）。事實(shí)上，在相同表面壓力下，表面密度的增加導(dǎo)致酶活性顯著降低，這表明GPI錨定酶的活性不僅取決于蛋白質(zhì)表面密度，還取決于混合單層或分子表面堆積的可壓縮性。

圖2.估計(jì)酶表面密度的影響（Γ）關(guān)于PNPPA酶活性。酶活性表示為在均勻介質(zhì)中測(cè)得的酶活性的百分比。最大值對(duì)應(yīng)于12.1 ng/cm2的酶表面密度。0-12 ng/cm2的范圍對(duì)應(yīng)于0-18 mN/m的表面壓力；但是，觀察到，在圖中所示的最高表面密度中，曲線不是t線性。圖3更好地分析了對(duì)表面壓力的依賴性。

圖3.（9）在幾種表面壓力下，DSAP/DMPA（1:3500，mol:mol）混合單分子膜中DSAP的PNPPA酶活性。（b）DSAP/DMPA混合單分子膜的壓縮模量。酶活性表示為均相介質(zhì)中估計(jì)值的百分比。

綜上所述，酶活性降低超過18 mN/m（每平方厘米12納克DSAP）與混合單分子層的液體凝聚相的實(shí)現(xiàn)相一致。因此，酶通過其錨插入的基質(zhì)包裝條件的變化可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的柔韌性產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，這是其功能活性的必要條件，盡管多肽部分之間的距離tive站點(diǎn)位于，并且接口。

然而，表面壓力和催化活性數(shù)據(jù)不能提供表面堆積如何影響酶/脂質(zhì)混合單層形態(tài)的信息。

熒光顯微鏡。熒光顯微鏡是一種通過熒光探針在薄膜中的分布來顯示氣液界面形貌的有趣方法。當(dāng)使用脂質(zhì)探針時(shí)，對(duì)比度取決于它們?cè)谘簩拥臐饪s和膨脹相中的相對(duì)溶解度，而使用熒光標(biāo)記的酶可以識(shí)別富含蛋白質(zhì)的區(qū)域。圖4顯示了使用約1 mol%用熒光素標(biāo)記的DSAP獲得的DMPA/DSAP混合單層的熒光顯微照片。在0 mN/m表面壓力下，在明亮的連續(xù)場(chǎng)上觀察到黑斑。在這種表面壓力下，純DMPA單分子膜中不存在這些結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域應(yīng)該對(duì)應(yīng)于在混合單分子膜上發(fā)生的某種分離，這種分離是由蛋白質(zhì)的存在引起的。隨著表面壓力的增加，可以觀察到一些這樣的區(qū)域聚集成分形圖案。從FM顯微照片中獲得的最重要的發(fā)現(xiàn)是DMPA/DSAP單分子膜中存在不均勻疇，隨著表面壓力的增加，這些疇變得更亮。在較高的表面壓力下，可能會(huì)看到具有三種不同光強(qiáng)度模式的區(qū)域。較亮的區(qū)域?qū)?yīng)于富含蛋白質(zhì)的區(qū)域，而較暗的區(qū)域應(yīng)對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)貧乏的區(qū)域，因?yàn)樵诳紤]標(biāo)記比率時(shí)，熒光素標(biāo)簽之間的熒光猝滅是極不可能的。在高于18 mN/m的表面壓力下觀察到的強(qiáng)亮度對(duì)應(yīng)于混合單層壓縮模量突然增加的范圍（見圖3）。

圖4.DSAP/DMPA單分子膜（1:3500，mol:mol）在幾種表面壓力下的熒光顯微照片。

高達(dá)18 mN/m時(shí)，分形圖案與單個(gè)暗疇共存。在20 mN/m時(shí)，暗域不再是離散的，但發(fā)生了滲流機(jī)制，導(dǎo)致明亮的富含蛋白質(zhì)的域最終分離。這幅圖可以歸因于富含蛋白質(zhì)的相被貧蛋白質(zhì)相包圍，呈分形滲流結(jié)構(gòu)分布。這與其他顯示GPI錨定蛋白在液相有序相中被劃分的報(bào)告一致。27

據(jù)報(bào)道，GPI錨定的蛋白質(zhì)在脂質(zhì)界面形成（或誘導(dǎo)形成）聚集體。6,8,27,30-34,52在生物膜模型如雙層膜、脂質(zhì)體、單層膜和Langmuir-Blodgett膜中也觀察到了這些簇。27,24,34，這些簇群是否是GPA介導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或脂質(zhì)組成的結(jié)果尚待闡明。17,32 FM研究的結(jié)果（圖4）表明DMPA/DSAP混合單分子膜中存在相分離以及脂質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體。

提出了將表面密度和表面堆積與催化活性關(guān)聯(lián)的模型。提出了一個(gè)通過脂質(zhì)表面堆積和氣液界面酶表面密度調(diào)節(jié)DSAP方向和催化活性的模型（圖5）。堿性磷酸酶的催化位點(diǎn)可能位于GPI錨的另一側(cè)。1,53在本研究所用的系統(tǒng)中，疏水錨應(yīng)位于與DMPA?；嗷プ饔玫目諝?水界面，而催化位點(diǎn)必須朝向亞相，其中基材PNPP溶解。在低表面壓力下（圖5A），催化活性主要取決于蛋白質(zhì)表面密度?？紤]到表面壓縮定義了平均酶表面密度（圖2），當(dāng)表面壓力上升到18 mN/m時(shí)，界面中的疏水錨定排列可能有利于多肽部分向亞相調(diào)整（圖5B）。這將允許PNPP在擴(kuò)散控制過程中進(jìn)入酶的催化部位，從而提高酶的活性，達(dá)到均相培養(yǎng)基中獲得的活性的91%（圖3）。盡管增加了酶的估計(jì)平均表面密度（圖2），但混合單層的進(jìn)一步壓縮會(huì)導(dǎo)致催化活性的突然降低，與單層壓縮性的顯著降低（圖3）和蛋白質(zhì)簇的形成（圖4）相關(guān)，這可能會(huì)影響底物對(duì)催化部位的可達(dá)性（圖5C）。該模型解釋了在30 mN/m條件下轉(zhuǎn)移的DSAP/DMPA混合LB膜23之前獲得的催化活性極限值約為43%。

圖5. 在（A）以下、（C）以上和（B）值的表面壓力下，酶/磷脂混合單層的DSAP取向示意圖模型，觀察到單層表面壓縮模量的突然增加。 橫向箭頭表示表面壓力（π）、估計(jì)的酶表面密度（Γ）和壓縮模量（Cs-1）的增加方向。

分子表面包裝對(duì)于磷脂單分子層膜中的錨定蛋白中酶活性的調(diào)制作用的影響——摘要、介紹

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