脂質(zhì)納米粒（Lipid Nanoparticle，LNP）是一種將核酸物質(zhì)遞送至細(xì)胞的納米載體，由可離子化陽(yáng)離子脂質(zhì)、中性輔助磷脂、膽固醇、PEG脂質(zhì)組成。制備過(guò)程采用乙醇注入法，將脂質(zhì)乙醇溶液與核酸物質(zhì)的酸性（pH=4）水性緩沖液迅速混合，在酸性條件帶正電的可電離脂質(zhì)與帶負(fù)電的核酸物質(zhì)靜電絡(luò)合形成納米粒；再以pH=7.4（高于陽(yáng)離子脂質(zhì)的pKa）的水性緩沖液對(duì)納米粒進(jìn)行透析洗濾，形成完整的脂質(zhì)納米粒-核酸遞送系統(tǒng)。

文丨塔卡拉瑪干的白楊

一、mRNA-LNP的結(jié)

關(guān)于mRNA-LNP的結(jié)構(gòu)示意圖，在認(rèn)識(shí)上存在一定的差異，不同的期刊有不同的結(jié)構(gòu)示意圖，甚至同一期刊還有不同的結(jié)構(gòu)示意圖。

首先在是Nature系列期刊中，就存在兩種明顯不同的示意圖，有的mRNA-LNP示意圖是單層膜結(jié)構(gòu)，而有的文章則描述為雙層膜結(jié)構(gòu)。Vaccines和Science期刊中描述的mRNA-LNP示意圖則類似于脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，為雙分子層結(jié)構(gòu)。Biotechnology Advances和Journal of Controlled Release期刊則選用了單層膜的mRNA-LNP示意圖。

圖1 Nature系列期刊的mRNA-LNP結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 Vaccines和Science期刊的mRNA-LNP結(jié)構(gòu)示意圖

圖3 Biotechnology Advances和Journal of Controlled Release期刊的mRNA-LNP結(jié)構(gòu)示意圖

Moderna公司描述的mRNA-LNP結(jié)構(gòu)示意圖，以及International Journal of Pharmaceutics和Advanced Drug Delivery Reviews期刊描述的mRNA-LNP結(jié)構(gòu)示意圖則更為抽象，尤其是International Journal of Pharmaceutics期刊，描述了三種不同的結(jié)構(gòu)。

圖4 Moderna公司的mRNA-LNP結(jié)構(gòu)示意圖

圖5 International Journal of Pharmaceutics和Advanced Drug Delivery Reviews期刊的mRNA-LNP結(jié)構(gòu)示意圖

筆者認(rèn)為，mRNA-LNP的脂質(zhì)膜到底為單層結(jié)構(gòu)還是為雙層結(jié)構(gòu)，目前的顯像技術(shù)尚不能完全區(qū)分和識(shí)別，但對(duì)LNP技術(shù)進(jìn)行溯源，可知其是在脂質(zhì)體的基礎(chǔ)之上發(fā)展而來(lái)，LNP有包載遞送核酸物質(zhì)的能力而脂質(zhì)體卻不能有效遞送核酸物質(zhì)，主要的區(qū)別在于LNP擁有實(shí)心內(nèi)核，能更好地保護(hù)核酸物質(zhì)不提前降解和釋放。此外，mRNA-LNP具有的內(nèi)部核心，其實(shí)質(zhì)是可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)與帶負(fù)電的核酸物質(zhì)靜電作用絡(luò)合形成復(fù)合體，被包載于內(nèi)部；倘若在不存在核酸物質(zhì)的情況下，可能形成的就是脂質(zhì)體，阿米卡星脂質(zhì)體吸入混懸液便是利用制備LNP微流控技術(shù)來(lái)生產(chǎn)的。

二、siRNA-LNP的形成機(jī)制

關(guān)于帶電荷脂質(zhì)和核酸物質(zhì)包裹形成納米粒，用于胞內(nèi)遞送的物理過(guò)程以及所形成的的結(jié)構(gòu)，目前尚未有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。

以2018年8月10日FDA批準(zhǔn)的Onpartro（Patisiran）為例，其作為首款采用LNP遞送siRNA的產(chǎn)品，是諾貝爾獎(jiǎng)成果從概念走向臨床實(shí)際應(yīng)用的里程碑。LNP-siRNA遞送系統(tǒng)是通過(guò)快速混合溶解脂質(zhì)的乙醇溶液和pH＝4.0的siRNA水性緩沖液，然后透析去除藥液中乙醇并調(diào)節(jié)pH＝7.4，形成LNP-siRNA。通過(guò)低溫透射電鏡觀察到，LNP對(duì)核酸物質(zhì)的包載效率接近100%，內(nèi)部電子密度均勻。分子模型和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，LNP是具有包含核酸物質(zhì)核心的納米結(jié)構(gòu)。

圖6 LNP的電鏡圖和結(jié)構(gòu)示意圖

1、形成機(jī)制的研究

關(guān)于脂質(zhì)納米粒的形成，曾經(jīng)提出過(guò)一個(gè)“倒置膠束”（inverted micelles）假說(shuō)，假說(shuō)認(rèn)為可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)先與核酸物質(zhì)締合形成反膠束結(jié)構(gòu)，過(guò)量的可電離脂質(zhì)則形成“空”反膠束；反膠束和“空”反膠束締合形成疏水核，極性較大的脂質(zhì)成分（如DSPC）再對(duì)疏水核進(jìn)行包裹。然而，該假說(shuō)并不能解釋脂質(zhì)納米粒制備過(guò)程中的某些特征現(xiàn)象，例如脂質(zhì)相和水相快速混合后的LNP-siRNA混懸液在pH＝4.0時(shí)呈澄清透明，這表明此時(shí)脂質(zhì)納米粒復(fù)合物的結(jié)構(gòu)直徑小于30nm；以緩沖液透析置換后LNP-siRNA混懸液呈半透明，表明在此過(guò)程中形成了較大結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)納米粒，也說(shuō)明脂質(zhì)納米粒的粒徑在該工藝過(guò)程中由小變大。

在此基礎(chǔ)上之上，不列顛哥倫比亞大學(xué)（Universityof British Columbia）教授彼得卡利斯（Pieter Cullis）對(duì)脂質(zhì)納米粒的形成過(guò)程進(jìn)行了深入的機(jī)制研究。Pieter Cullis教授在40多年前揭開(kāi)了脂質(zhì)納米粒應(yīng)用的序幕，他的實(shí)驗(yàn)室為脂質(zhì)藥物遞送系統(tǒng)的發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。

相關(guān)閱讀：詳解LNP作為藥物遞送技術(shù)的起源和專利糾紛

Pieter Cullis教授對(duì)Onpattro（首款上市的LNP產(chǎn)品）的處方進(jìn)行了考察，Onpattro的處方為可電離脂質(zhì)/DSPC/膽固醇/PEG化脂質(zhì)= 50/10/38.5/1.5（mol/mol），N/P=3。冷凍電鏡結(jié)果顯示，在pH=4的水溶液中，形成的是粒徑較小的澄清透明的脂質(zhì)納米混懸液；在緩沖液透析和置換的過(guò)程中，溶液的pH逐漸升高至7.4，受pH值的驅(qū)動(dòng)，脂質(zhì)納米粒在中性水溶液中逐步融合，形成粒徑較大的脂質(zhì)納米粒，納米粒的中心形成多層堆疊的固體核心結(jié)構(gòu)。初步估算平均每36個(gè)小粒子聚集成一個(gè)脂質(zhì)納米粒。

此外還發(fā)現(xiàn)，采用乙醇稀釋/快速混合技術(shù)制備LNP-siRNA，當(dāng)siRNA含量較高時(shí)，表現(xiàn)為堆疊的小雙層結(jié)構(gòu)，其中siRNA被包載于緊密相連的脂質(zhì)雙分子層之間；當(dāng)siRNA含量較低時(shí)，堆疊結(jié)構(gòu)的比例降低，LNP-siRNA復(fù)合物系統(tǒng)則表現(xiàn)出siRNA雙層結(jié)構(gòu)和非晶態(tài)電子致密核的組合，這可能是由中性形式的可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)產(chǎn)生的油滴而形成。所得結(jié)論為：含可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)的LNP體系在pH＝4時(shí)形成雙層結(jié)構(gòu)，在pH＝7.4時(shí)形成非晶態(tài)“固體核”結(jié)構(gòu)。

2、影響LNP形成的因素

使用帶電荷脂質(zhì)制備siRNA-LNP時(shí)，正電荷與負(fù)電荷的數(shù)量比會(huì)影響納米粒的大小、穩(wěn)定性、電位等性能。在siRNA-LNP中，正電荷通常為具有可電離銨根（N）的陽(yáng)離子脂質(zhì)，而負(fù)電荷則為帶有大量磷酸根（P）的核酸分子，兩者可通過(guò)靜電吸附的方式結(jié)合在一起。因此，不合理的比例可能會(huì)導(dǎo)致粒徑過(guò)大、穩(wěn)定性差等缺陷。值得一提的是，在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)N/P＝1時(shí)，pH中和后LNP的粒徑不會(huì)有較大改變；當(dāng)N/P＝3或者6時(shí)，LNP在pH＝7.4的緩沖液中粒徑會(huì)變大。而永久陽(yáng)離子脂質(zhì)（例如DOTAP）制備的LNP在任何pH緩沖液中都不具有固體核心結(jié)構(gòu)。

圖7 不同的N/P會(huì)影響LNP的粒徑

圖8 永久陽(yáng)離子脂質(zhì)制備的LNP無(wú)固態(tài)核心

同時(shí)研究了siRNA的存在對(duì)LNP的形成機(jī)制和結(jié)構(gòu)的影響。在沒(méi)有siRNA存在的情況下，LNP脂質(zhì)分散體在pH＝4.0的條件下快速混合形成粒徑較小的單層小泡；隨著PBS緩沖液的透析pH值升高至7.4，較多的可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)以中性形式存在，囊泡間的靜電排斥力降低，使得雙分子層結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變差囊泡間產(chǎn)生融合；當(dāng)小囊泡融合時(shí)，PEG脂質(zhì)、DSPC和膽固醇被分割到越來(lái)越大的LNP單外層，而中性的可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)被分割到LNP的內(nèi)部并在LNP中心形成油滴相；當(dāng)外單分子層的PEG脂質(zhì)濃度足夠高時(shí)，會(huì)抑制LNP之間的繼續(xù)融合，從而維持平衡態(tài)。值得注意的是，雖然平衡態(tài)粒徑的大小與PEG脂質(zhì)的濃度有關(guān)，但其影響力比DSPC和膽固醇含量的影響要小得多。

圖9 無(wú)siRNA情況下LNP的形成

在有siRNA存在的情況下，最初是在緊密相連的脂質(zhì)單層之間形成包含siRNA的小囊泡；隨著pH值的升高，類似于不含siRNA的LNP，可電離脂質(zhì)電位的中和會(huì)誘導(dǎo)脂質(zhì)顆粒間的融合，這個(gè)過(guò)程受到復(fù)合物中PEG脂質(zhì)、DSPC和膽固醇的相分離限制；有科學(xué)家提出，這些脂質(zhì)沉積在表面單層，抑制脂質(zhì)顆粒進(jìn)一步融合。值得注意的是，高濃度乙醇（體積比不小于25%）會(huì)導(dǎo)致除單個(gè)脂質(zhì)分子的高交換率（與siRNA復(fù)合的陽(yáng)離子脂質(zhì)除外），從而使得快速形成平衡結(jié)構(gòu)；還需要指出的是，必須要有部分DSPC和膽固醇被分割在外單層，并且在pH＝4時(shí)能維持更小結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，因?yàn)樵诤?.5 mol % PEG脂質(zhì)且沒(méi)有DSPC或膽固醇的體系中能觀察到非常大的微米級(jí)系統(tǒng)；隨著pH的升高，納米顆粒經(jīng)歷的過(guò)程與不含siRNA時(shí)LNP的情況基本相同；可電離脂質(zhì)向中性形式轉(zhuǎn)化的過(guò)程更利于增加在LNP內(nèi)核中的融合和沉積。

圖10 有siRNA情況下LNP的形成

3、結(jié)論

LNP-siRNA復(fù)合物是通過(guò)快速混合-乙醇稀釋過(guò)程形成，該復(fù)合物并沒(méi)有顯示出倒置的膠束結(jié)構(gòu)，其中siRNA以“醋栗小圓面包”（currant bun）的形式分散在LNP內(nèi)部。相反，siRNA與緊密貼合的脂質(zhì)雙層膜相關(guān)，雙層脂質(zhì)膜固定住siRNA分子，分離到LNP的外圍。過(guò)量的可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)會(huì)形成一個(gè)無(wú)定形的脂質(zhì)核心，類似于含有一定量膽固醇的油滴相。

這些研究表明，在優(yōu)化的LNP-siRNA遞送系統(tǒng)中，不同種類脂類的比例可能會(huì)根據(jù)特定的可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)而變化。例如，使用KC2脂質(zhì)時(shí)，膽固醇在疏水核中的有限溶解度表明，應(yīng)降低膽固醇含量以實(shí)現(xiàn)更穩(wěn)定的體系?；蛘?，增加DSPC的用量可能會(huì)增強(qiáng)較小的LNP給藥系統(tǒng)的穩(wěn)定性和活性。此前已有研究表明，較小的LNP-siRNA給藥系統(tǒng)不如較大的給藥系統(tǒng)有效。

三、脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米顆粒

脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米粒的關(guān)鍵差異，不僅在于他們各自的應(yīng)用不同，更主要在于他們自身的形態(tài)結(jié)構(gòu)、組成和生產(chǎn)工藝存在差異。

從廣泛定義來(lái)講，脂質(zhì)納米粒是以脂質(zhì)形成的納米顆粒，這么劃分的話脂質(zhì)體也是一種脂質(zhì)納米粒。然而，在具體的科學(xué)研究中，脂質(zhì)納米粒是用來(lái)描述一種不同于脂質(zhì)體的特定類型納米粒。脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米粒的最大區(qū)別在于形態(tài)，脂質(zhì)體是脂質(zhì)有序排列的雙分子層形成封閉囊泡，有親水的內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)；脂質(zhì)納米粒則沒(méi)有親水空腔，相反，脂質(zhì)納米粒因?yàn)殛?yáng)離子磷脂和帶負(fù)電的核酸物質(zhì)靜電絡(luò)合作用存在于內(nèi)部，形成的多層核心分散于脂質(zhì)層間。

在組成方面，主要成分大致相同，都含有脂質(zhì)和膽固醇，只是脂質(zhì)納米粒所用的脂質(zhì)中必須要有可電離脂質(zhì)，而脂質(zhì)體對(duì)脂質(zhì)的種類沒(méi)有嚴(yán)格要求。但在各成分的比例方面，脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米粒存在較大差異，尤其是膽固醇的用量，以經(jīng)典的脂質(zhì)體產(chǎn)品DOXIL為例，HSPC：CHOL：DSPE-PEG2000＝3：1：1；而已上市兩款mRNA新冠疫苗的組分中，膽固醇分別占比42.7%（Pfizer/BioNTech）和38.5%（Moderna），明顯高于脂質(zhì)體中膽固醇的含量。

圖11 脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米粒的差別

在生產(chǎn)工藝方面，脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米粒在上游的工藝和步驟是不同的，但下游的生產(chǎn)過(guò)程幾乎一致。傳統(tǒng)的脂質(zhì)體制備工藝，首先是脂質(zhì)相和水相形成粗脂質(zhì)體，再通過(guò)均質(zhì)或擠出工藝將粒徑控制在一定的范圍內(nèi)；而脂質(zhì)納米粒是利用微流混合系統(tǒng)將脂質(zhì)乙醇溶液和核酸酸性水溶液快速混合，微流混合系統(tǒng)的連接頭可以在兩相混合對(duì)撞過(guò)程中控制粒徑。脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米粒下游的緩沖液置換工藝幾乎一樣，都是利用切向流動(dòng)過(guò)濾（Tangential Flow Filtration，TFF）技術(shù)進(jìn)行緩沖液的置換或純化，最后終端0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。

圖12 切向流動(dòng)過(guò)濾技術(shù)示意圖

脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米粒同宗同源，脂質(zhì)體已在藥物遞送領(lǐng)域扮演重要角色，涉及到眾多適應(yīng)癥，而脂質(zhì)納米粒目前僅用于核酸物質(zhì)的遞送，希望其在技術(shù)的積累和開(kāi)發(fā)下得到廣泛應(yīng)用。