經(jīng)過一次、二次常規(guī)采油之后，遺留在地層的殘余油仍然占石油總量的60%～70%。如何最大限度地開采出地下剩余的原油，已經(jīng)成為石油工業(yè)的重要任務(wù)。Zobell在1946年發(fā)表了利用微生物提高石油采收率的專利，并發(fā)現(xiàn)微生物提高石油采收率的機(jī)理之一是微生物代謝過程中產(chǎn)生了生物表面活性劑。產(chǎn)生表面活性劑的微生物種類很多，如酵母菌、真菌、細(xì)菌等。能以原油組分為碳源和能源產(chǎn)生生物表面活性劑的微生物，是微生物采油的首選菌種?，F(xiàn)已知的能應(yīng)用于微生物采油的菌種有近30個(gè)屬100多種。利用不同的培養(yǎng)基對(duì)不同的菌種進(jìn)行培養(yǎng)、馴化，獲得了可以產(chǎn)生大量表面活性劑、對(duì)稠油具有較強(qiáng)的分散、乳化作用的菌種。從污水中分離到的一株地衣芽孢桿菌可以耐受高溫和高濃度鹽，且對(duì)原油具有較強(qiáng)的乳化、增溶和降黏作用。Ghojavand等在兼性厭氧條件下篩選出耐高溫(60℃)、高礦化度(15%NaCl)的枯草芽孢桿菌，該菌對(duì)原油具有較強(qiáng)的降黏作用。研究生物表面活性劑產(chǎn)生菌在微生物采油過程中的生長規(guī)律，探討其作用機(jī)理，對(duì)微生物采油技術(shù)的改進(jìn)和完善具有十分重要的理論和實(shí)際意義。

本研究通過原油平板培養(yǎng)法，篩選出3株生物表面活性劑產(chǎn)生菌，對(duì)各菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)和初步鑒定；測定各菌株在發(fā)酵過程中發(fā)酵液表面張力、pH、菌體密度和細(xì)胞疏水性等特征參數(shù)；對(duì)各菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑組成進(jìn)行分析。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌源

盤錦油田被原油污染的土壤。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基及其制備方法

液體富集培養(yǎng)基(g/L)：原油3.0，NaCl 3.0，NH4Cl 0.1，MgSO40.02，NaNO30.2，KH2PO40.1，K2HPO40.2，pH 7.0。于1.03×105Pa滅菌30 min。

平板富集培養(yǎng)基(g/L)：原油3.0，蛋白胨5.0，瓊脂20.0，NaCl 3.0，NH4Cl 0.1，MgSO40.02，NaNO30.2，KH2PO40.1，K2HPO40.2，pH 7.0。于1.03×105Pa滅菌30 min。

平板分離及保藏培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖3.0，蛋白胨8.0，酵母膏3.0，KH2PO42.7，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH 7.0。于0.8×105Pa滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 5.0，牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，pH 7.0，于1.03×105Pa滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO43.4，Na2HPO41.5，(NH4)2SO44.0，MgSO4·7H2O 0.7，酵母粉0.2，液體石蠟17，pH 7.0，于1.03×105Pa滅菌30 min。

1.2.2菌源微生物的富集

稱取土樣10 g，加入生理鹽水90 mL，振蕩均勻，靜止12 h。取上清液按10%接種量接種到液體富集培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)3 d。連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)3次。

1.2.3生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分離、篩選與鑒定

生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分離、初篩：將液體富集培養(yǎng)液用無菌生理鹽水稀釋105、106、107倍，每個(gè)稀釋度取0.1 mL菌液涂布于平板富集培養(yǎng)基上，于30℃靜置培養(yǎng)4 d。將平板富集培養(yǎng)基上有乳化圈或噬油斑的菌落，進(jìn)一步在平板分離培養(yǎng)基上劃線分離純化，挑取單菌落保藏在斜面保藏培養(yǎng)基上。

生物表面活性劑產(chǎn)生菌的復(fù)篩：將斜面保存的初篩菌株接種在種子培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)1～3 d，再以體積分?jǐn)?shù)為5%的接種量將種子培養(yǎng)液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。根據(jù)液體石蠟被乳化及發(fā)酵液表面張力的變化，篩選出產(chǎn)生物表面活性劑的優(yōu)勢菌株。

生物表面活性劑產(chǎn)生菌的鑒定：根據(jù)《伯杰氏(Berge)菌種鑒定手冊(cè)》對(duì)分離得到的部分菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化鑒定。

1.2.4生物表面活性劑提取與分析

1.2.4.1生物表面活性劑的提取

將發(fā)酵液用濾紙過濾除油，濾液于3 000g離心20 min除菌，取上清液加入等體積的氯仿和甲醇(體積比為2∶1)的混合液，萃取3次。將萃取后的有機(jī)相于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得表面活性劑粗品。

1.2.4.2生物表面活性劑的化學(xué)組成分析

將發(fā)酵液用濾紙過濾除油，濾液于3 000g離心20 min除菌，取上清液加入等體積氯仿和甲醇(體積比為2∶1)萃取所得有機(jī)相進(jìn)行薄層層析。以氯仿、甲醇和水(體積比為65∶15∶2)為展開劑，以苯酚-硫酸試劑為顯色劑，顯棕色斑點(diǎn)為糖脂；以茚三酮試劑為顯色劑，顯紅色斑點(diǎn)為脂肽。

取150 mg樣品加入2 mol/L H2SO4，于100℃密封水解8 h，用BaCO3中和至中性，3 000g離心10 min，取上清液進(jìn)行薄層層析。以氯仿、甲醇和水(體積比為65∶15∶2)為展開劑，以苯酚-硫酸試劑為顯色劑，以鼠李糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

薄層層析用硅膠板為德國Merck公司產(chǎn)品silica gel 60 F254。

1.2.5生物表面活性劑產(chǎn)生菌的生長特性

菌體密度的測定：采用濁度法。移除發(fā)酵液上層油相，取發(fā)酵液3 mL，加入TritonX-100(0.2%)溶液0.5 mL，漩渦振蕩1 min，于3 000g離心20 min，倒掉上清液，用3 mL去離子水重懸菌體，以去離子水為空白，于600 nm測定菌懸液的光密度OD600，以此表示發(fā)酵液的菌體密度。

疏水性(BATH)測定：采用BATH測定方法。移除發(fā)酵液上層油相，取發(fā)酵液3 mL，測定OD′600。加入石油醚0.1 mL，振蕩1 min，靜置30 s，再振蕩1 min，于30℃水中靜置15 min，取下層液體測定OD600。細(xì)胞疏水性BATH=OD600/OD′600。

表面張力測定：采用表面張力儀(芬蘭Kibron公司)測定。將發(fā)酵液用濾紙過濾除油，濾液于3 000g離心20 min除菌，取上清液測定表面張力。

pH測定：采用pH3-3C精密pH計(jì)測定。將發(fā)酵液用濾紙過濾除油，濾液于3 000g離心20 min除菌，取上清液測定pH。

生物表面活性劑產(chǎn)生菌菌體密度、細(xì)胞疏水性與發(fā)酵液pH及表面張力的關(guān)系（一）

生物表面活性劑產(chǎn)生菌菌體密度、細(xì)胞疏水性與發(fā)酵液pH及表面張力的關(guān)系（二）