二、材料與方法

2.1. 材料

主要構(gòu)成重建膜外葉的脂質(zhì)購(gòu)自 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) 并按原樣使用。 化合物 1- 棕櫚酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿 (PC (16:0/22:6), Mw = 806.1, 純度 > 99%) 和 1-(1Z-十八碳烯基)-2- 二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿 PC (P-18:0/22:6, Mw = 818.2，純度 > 99%) 作為氯仿溶液 (10 mg mL-1) 獲得。 PC (16:0/22:6) 和 將 P-PC (18:0/22:6) 稀釋以獲得 1.25 mg mL-1 溶液。 來(lái)自綿羊毛的膽固醇（Chol，Mw = 711.0，純度 > 98%）和 來(lái)自雞蛋的鞘磷脂（SM，Mw = 386.7，純度 > 98%） 以粉末形式獲得。 兩者都溶于氯仿 （HPLC 級(jí)，Carlo Erba，Val de Reuil，法國(guó)）濃度為 1.25 毫克毫升-1。

冷凍保護(hù)培養(yǎng)基由 Trizma 堿組成 (173.0 mM)，檸檬酸一水合物 (70.0 mM)，果糖 (56.0 mM)、甘油 (6.4%; v/v)，最后是抗生素（青霉素 G 鈉 391 mg L?1，硫酸鏈霉素 856 mg L?1，林可霉素 鹽酸鹽 204 mg L?1，硫酸壯觀霉素四水合物 585 mg L-1)（Sigma-Aldrich，St. Quentin Fallavier，法國(guó)）。 這 pH 值調(diào)整為 6.2，其滲透壓約為 1300.0 摩爾滲透壓。

2.2. 低密度脂蛋白的提取

從蛋黃中提取低密度脂蛋白 (LDL) 根據(jù)穆薩等人的協(xié)議。 [31]。 提取后，LDLs 的濃縮提取物（22 ± 0.5 g 相當(dāng)于 8.36 g 干 LDL）在冷凍保護(hù)培養(yǎng)基中稀釋 (100 毫升)。 低密度脂蛋白樣品中蛋白質(zhì)的定量 微 BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（Pierce，Thermoscientific，法國(guó)）提供 8.9 ± 1.0 毫克毫升-1。 低密度脂蛋白樣品中 PC 磷脂的含量 由雞蛋中 PC 的自然比例計(jì)算得出（18.4 g PC/100 g ofdry LDLs) 由 Antonet al. [33] 給出。它等于 15.4 g L?1 LDLs 樣本。 低密度脂蛋白還包含一小部分 PE (PC/PE 6:1) [33]。

2.3. 收集血漿精液

牛精子是從一頭 Prim Holstein 公牛身上收集的，并且 立即以 10,000 × g 離心兩次以回收精液 上清液中的血漿。 我們樣品的蛋白質(zhì)含量 是 88.5 ± 5.0 mg mL-1，由微 BCA 蛋白確定 檢測(cè)試劑盒（Pierce，Thermoscientific，法國(guó)）。

2.4. 脂質(zhì)體的制備

脂質(zhì)體由卵磷脂的提取物制成 使用迷你擠出機(jī)通過(guò)擠出在冷凍保護(hù)緩沖液中 來(lái)自 Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, USA)。 的提取物 卵磷脂由磷脂酰膽堿 (73%) 和 磷脂酰乙醇胺 (11%) 和少量成分，包括甘油三酯和鞘磷脂。 提取物在 冷凍保護(hù)緩沖液在脂質(zhì)濃度為 分別為 3.90 mg mL-1 (C1)、7.28 mg mL-1 (C2)、14.56 mg mL-1 (C3) 和 21.84 mg mL-1 (C4)。 然后對(duì)分散液進(jìn)行超聲處理 在超聲波浴（來(lái)自德國(guó)辛根 Elma 的 Elmasonic S 30H，功率為 275W）中持續(xù) 15 分鐘。 最后，分散是 在擠出機(jī)中擠出（20 次通過(guò) 100 nm 膜）。 分布尺寸以 120 nm 為中心，Zeta 電位 值為 -6 mV。 在 BSP 存在下引入的脂質(zhì)體量以重量表示（1.17 mg、2.18 mg、4.37 mg 和 6.55 mg 脂質(zhì)，用于脂質(zhì)體分散體 C1、C2、C3 和 C4 分別）。 不確定度為 0.01 毫克。

2.5. 電泳

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 在還原條件下進(jìn)行。 開(kāi)創(chuàng)性的 將血漿溶解在由 Tris 0.5 M 組成的 pH 6.8 緩沖液中， SDS 10%、甘油 30% w/w 和溴酚藍(lán) 0.4% 得到 1 mg mL-1 溶液。 9% 巰基乙醇 v/v 是 加入樣品，渦旋混合，隨后加熱至 95°C 5 分鐘。 那么，10 ? L 低范圍分子量 標(biāo)準(zhǔn)（來(lái)自 Euromedex、Souffelweyersheim、 法國(guó)) 和 10 到 25 ? L 精漿裝載在 15%- 聚丙烯酰胺凝膠（pH 6.8-Tris 0.5 M 和 SDS 0.10%）偶聯(lián) 使用由 Tris 0.025 M、甘氨酸組成的 pH 8.3 遷移緩沖液 0.192 M，SDS 0.1%。 電泳在 20 mA 下進(jìn)行， 凝膠用考馬斯藍(lán) G250 溶液染色。 染色的 最后掃描凝膠并評(píng)估峰的強(qiáng)度 通過(guò) Multi Gauge 軟件（2.0 版，F(xiàn)uji Photo Film Co., Ltd.， 日本）。

2.6. 表面活性測(cè)量

測(cè)量吉布斯膜（通過(guò)從精漿溶液擴(kuò)散到空氣-緩沖液界面而形成）的表面張力 在 15 孔板（鋁底多孔板，帶有 Teflon 輪輞）安裝在朗繆爾天平（微槽 XL-LB，Kibron Inc., Helsinki, Finland）配備高靈敏度傳感器（使用合金線的威廉米法）。 該設(shè)備被放置在一個(gè) 溫度控制區(qū)域固定在 23°C，并用純蒸餾水校準(zhǔn)（Milli-Q 系統(tǒng)，Millipore，美國(guó)）。 測(cè)量精度為 0.1 mN/m。 精漿被放置在 第一個(gè)孔然后在下一個(gè)孔中稀釋 2 倍，依此類(lèi)推（每個(gè) 井的體積為 300 ? L)。 重復(fù)測(cè)量 每種精漿提取物 4 次 (n = 2)。 結(jié)果是 表示為所有測(cè)量值的平均值。

在配備傳感器的先前朗繆爾槽上測(cè)量蛋白質(zhì)膜的壓縮等溫線 （微槽 XL-LB，Kibron Inc.，赫爾辛基，芬蘭）。 開(kāi)創(chuàng)性的 血漿首先在冷凍保存的緩沖液中稀釋?zhuān)?/100） 并在緩沖液表面逐滴（50 升）展開(kāi)。 這 在平衡 20 分鐘后和在室溫 (23°C) 下記錄壓縮等溫線。

2.7. 外葉脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域的重建 精子膜

精子外葉的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域 如前所述[35]重建膜。 這 Langmuir 槽 (302LL, Nima Technology, UK) 被插入一個(gè) 自制手套箱放在防震臺(tái)上并沖洗 用氬氣防止脂質(zhì)氧化。 測(cè)量表面壓力 使用由過(guò)濾器制成的 Wilhelmy 板，精度為 0.1 mN/m 紙（Whatman 的無(wú)灰 Whatman 色譜紙） International Ltd., Maidstone, Kent, UK) 連接到一個(gè)電 平衡。 環(huán)境溫度固定在 20℃。 所有燒瓶 和注射器被引入手套箱，然后 在鋪展單層之前用氬氣脫氣 1 小時(shí)。 朗繆爾天平的溫度是恒溫控制的 通過(guò)設(shè)置在 40 ℃ 的循環(huán)水系統(tǒng)。 真實(shí)溫度 緩沖液表面的溫度為 34°C。 子階段包括 冷凍保護(hù)介質(zhì)。 膽固醇、鞘磷脂、P-PC (18:0/22:6) 和 PC (16:0/22:6) 的氯仿溶液 適當(dāng)?shù)哪柋龋?1:14:16:39）逐滴展開(kāi) 到緩沖子階段 25 ? L 微量注射器（精確到 0.5 ? L)（Hamilton Bonaduz AG，Bonaduz，瑞士）。 在壓縮之前，讓單層平衡 10 分鐘 以 40 cm2/min 的屏障速度啟動(dòng)。 一旦達(dá)到目標(biāo)壓力 (25 mN/m)，壓力就會(huì)保持不變 通過(guò)使用可移動(dòng)障礙物調(diào)整表面積來(lái)保持恒定。 由于單層在 30 mN/m 下隨時(shí)間不夠穩(wěn)定 這是與脂質(zhì)堆積密度相關(guān)的薄膜壓力 雙層 [36]，我們將目標(biāo)壓力降低到 25 mN/m，其中 單層更穩(wěn)定（見(jiàn)結(jié)果）。

一旦達(dá)到目標(biāo)壓力 (25 mN/m)， 在引入解決方案之前保持 1000 s 生物分子（低密度脂蛋白、BSP 或脂質(zhì)體）進(jìn)入亞相 彎針注射器。 針遠(yuǎn)離尖端彎曲 躺在槽的底部，以便注射 在壓縮亞相之下執(zhí)行。 等量的體積（每種添加劑 0.3 毫升）之前被移除 障礙。 注入生物分子后，面積變化 監(jiān)測(cè)每個(gè)脂質(zhì)分子并表示為變化 相對(duì)于初始值 (A/A= (A?A(t0)) × 100/A(t0))。 它有 被跟蹤了 3000 秒，時(shí)間對(duì)應(yīng)于處理 冷凍保存前的精液。 在這種恒壓模式下， 生物分子插入脂質(zhì)單層導(dǎo)致 通過(guò)增加而降低的薄膜壓力的增加 表面積。 反之，表面積減少 生物分子導(dǎo)致脂質(zhì)單層溶解在亞相中。 重復(fù)所有數(shù)據(jù)，偏差不超過(guò)5% 的表面積。

圖 1. 從牛精液中分離的精漿的 SDS-PAGE 凝膠和 以不同濃度沉積：泳道 1:1 ? G; 車(chē)道 2:2 ? G; 車(chē)道 3:5 ? g和車(chē)道 4:10？ G。

2.8. 低溫透射電子顯微鏡 (cryo-TEM)

使用cryoplunge冷凍固定裝置（Gatan，USA）制備冷凍TEM觀察標(biāo)本，其中一滴 將水懸浮液沉積在輝光放電的多孔型碳涂層網(wǎng)格（Ted Pella Inc.，美國(guó)）上。 TEM 網(wǎng)格是 然后通過(guò)吸干含有樣品的液滴來(lái)制備 支撐碳膜中的孔中保留有薄薄的液體層。 通過(guò)快速插入網(wǎng)格使液膜玻璃化 轉(zhuǎn)化為由液氮冷卻的液態(tài)乙烷。 玻璃化標(biāo)本安裝在 Gatan 910 標(biāo)本架（Gatan，美國(guó)） 使用 CT-3500-cryotransfer 插入顯微鏡 系統(tǒng)（Gatan，美國(guó)）并用液氮冷卻。 透射電鏡圖像 然后從保存在玻璃冰中的標(biāo)本中獲得 懸浮在支撐碳基板上的孔中。

在低劑量條件下觀察樣品 (<10 e-/A2)，-178 ℃，使用 JEM 1230 'Cryo' 顯微鏡（Jeol， Japan) 在 80 kV 下運(yùn)行并配備了 LaB6 燈絲。 全部 顯微照片記錄在 Gatan 1.35K × 1.04K × 12 位 ES500W CCD 相機(jī)。 采集了 50 多張圖像系列 對(duì)于來(lái)自多個(gè)樣品制備的每個(gè)樣品，具有不同的 放大倍數(shù)，以確保觀察的良好重復(fù)性。

應(yīng)用不同組裝的磷脂酰膽堿對(duì)牛精漿蛋白的隔離——摘要、簡(jiǎn)介

應(yīng)用不同組裝的磷脂酰膽堿對(duì)牛精漿蛋白的隔離——材料與方法

應(yīng)用不同組裝的磷脂酰膽堿對(duì)牛精漿蛋白的隔離——結(jié)果與討論

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