摘要

在這里，我們使用朗繆爾槽研究了乳清分離蛋白（WPI）和疏水蛋白HFBII在空氣/水界面的擴(kuò)散層和吸附層的表面膨脹特性，并將其與泡沫能力和穩(wěn)定性聯(lián)系起來。在擴(kuò)散和吸附系統(tǒng)中，觀察到模量隨著HFBII在表面或本體中的分?jǐn)?shù)逐漸增加，我們可以確定WPI主導(dǎo)和HFBII主導(dǎo)行為的不同區(qū)域。通過目視觀察槽表面出現(xiàn)的微觀皺紋，進(jìn)一步證實(shí)了HFBII的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)比較擴(kuò)散和吸附系統(tǒng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)需要更高的HFBII分?jǐn)?shù)才能在擴(kuò)散層中獲得HFBII主導(dǎo)行為，而不是吸附層（fHFBII分別為0.6和0.2）。此外，我們的結(jié)果表明，在連續(xù)的大規(guī)模壓縮/膨脹循環(huán)中，HFBII對(duì)界面行為的貢獻(xiàn)變得更加顯著。為了解釋這種非平凡的行為，我們建議在界面處形成多層結(jié)構(gòu)，頂層富含HFBII，底層富含WPI。泡沫的粗化穩(wěn)定性與吸附層的表面膨脹特性比擴(kuò)散層的表面膨脹特性更接近。最后，觀察到，在HFBII和WPI的混合體系中，粗化過程趨于平穩(wěn)，這與HFBII在混合WPI:HFBII層中的主導(dǎo)地位隨著收縮氣泡表面發(fā)生的大表面變形而增加。

1.介紹

疏水蛋白是絲狀真菌產(chǎn)生的一類具有高度表面活性的蛋白質(zhì)。它們的生物學(xué)功能是介導(dǎo)（氣生）菌絲、孢子和子實(shí)體的形成，在此過程中，親水和疏水環(huán)境（即細(xì)胞材料和空氣）之間形成一個(gè)大界面[1]。

疏水蛋白由100±25個(gè)氨基酸組成，具有8個(gè)半胱氨酸殘基的特征模式，形成4個(gè)分子內(nèi)二硫鍵[2]，使蛋白質(zhì)分子非常緊密且堅(jiān)硬。疏水蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示出明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)[3-5]。根據(jù)其水溶性和親水性模式，疏水蛋白可分為兩類[4]。I類疏水蛋白是最具表面活性的，但水溶性很低，因此難以在實(shí)際應(yīng)用中使用。II類蛋白的表面活性略低（與1類疏水蛋白相比，但與任何其他蛋白質(zhì)類相比，仍然非常出色），并具有良好的水溶性。對(duì)于II類疏水蛋白，HFBII是小分子量（7.2 kDa）和4個(gè)二硫鍵的獨(dú)特組合，可防止疏水部分重排到蛋白質(zhì)核心，并使其暴露于周圍介質(zhì)中。因此，在水環(huán)境中，HFBII表現(xiàn)為天然Janus顆粒[4]，具有不同的親水性和疏水性表面補(bǔ)丁，從而導(dǎo)致不同的兩親性行為以及本體和表面自組裝。

最近，Cox等人[6]研究了HFBII的表面性質(zhì)，并用其解釋了簡(jiǎn)單氣泡團(tuán)中極低的空氣溶解速率。在后續(xù)工作中，Cox等人[7]證明了HFBII可以用于生產(chǎn)液體泡沫，這種泡沫在幾個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定。因此，這些分子被描述為空氣結(jié)構(gòu)蛋白。這種穩(wěn)定性是異常的，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下，液體泡沫會(huì)通過歧化過程穩(wěn)定地變粗[7,8]。正因?yàn)槿绱?，人們往往依賴于體積彈性來穩(wěn)定泡沫，從而限制了應(yīng)用量，例如面包、冰淇淋或慕斯和巴瓦羅甜點(diǎn)[9]。

現(xiàn)在，HFBI穩(wěn)定化泡沫中歧化的異常穩(wěn)定性可以用非凡的表面性質(zhì)來解釋：HFBII具有極高的解吸能，它看起來是一種致密、堅(jiān)硬且粘性的顆粒[8,10]。因此，HFBII表層在振蕩和穩(wěn)定膨脹狀態(tài)下都具有出色的表面剪切和膨脹模量[8,11]。此外，它們?cè)诔掷m(xù)壓縮時(shí)顯示出褶皺形成，這與表層的彎曲彈性有關(guān)[10]。

當(dāng)將這些空氣結(jié)構(gòu)蛋白應(yīng)用到消費(fèi)品中時(shí)，它們幾乎不可避免地會(huì)遇到其他同樣具有表面活性的成分，例如蛋白質(zhì)。例如，眾所周知，混合蛋白質(zhì)和/或乳化劑系統(tǒng)的表面性質(zhì)可能與純系統(tǒng)的表面性質(zhì)截然不同，這可能導(dǎo)致乳液或泡沫的穩(wěn)定或不穩(wěn)定[12–14]。最近，關(guān)于HFBII和-酪蛋白混合層的表面剪切流變學(xué)的數(shù)據(jù)也已公布，為此類層的分層提供了詳細(xì)的假設(shè)[15]。

為了探索其他蛋白質(zhì)對(duì)HFBII作為泡沫歧化穩(wěn)定劑的功能性的影響，本文致力于HFBII和乳清分離蛋白（WPI）的混合體系。在WPI中，主要蛋白質(zhì)是-乳球蛋白：一種具有代表性且經(jīng)過充分研究的球狀食品蛋白質(zhì)，分子量約為18 kDa，等電點(diǎn)為5.1，在吸附到界面時(shí)能夠展開[8,16–20]。

該研究的目的是將已知成分的混合層的行為與混合物的發(fā)泡行為關(guān)聯(lián)起來。為此，我們選擇了三個(gè)步驟來接近這些極限：第一步是研究HFBII:WPI水溶液混合物層的膨脹表面性質(zhì)，這些混合物分布在純空氣/水界面上，從而確定界面處蛋白質(zhì)的初始組成。由于這兩種蛋白質(zhì)都相對(duì)較大（它們是大分子），并且具有顯著的表面活性和附著能，因此預(yù)計(jì)不會(huì)有（或不可逆的）蛋白質(zhì)脫附到整體上。因此，在壓縮/膨脹循環(huán)期間，蛋白質(zhì)濃度和組成預(yù)計(jì)保持不變。在第二步中，我們使用吸附系統(tǒng)，制備具有已知體積組成的兩種蛋白質(zhì)的水溶液，并使該系統(tǒng)在空氣/水中自發(fā)吸附，并與體積平衡。很明顯，在這種情況下，由于蛋白質(zhì)對(duì)界面的親和力不同，體積和表面成分可能不同。當(dāng)我們開始?jí)嚎s/膨脹循環(huán)以探索表面膨脹流變學(xué)時(shí)，由于多種原因，表面成分也可能發(fā)生變化。在膨脹循環(huán)期間，蛋白質(zhì)可能在表面積聚，在界面和表面下重新排列，可能形成多層，在壓縮循環(huán)期間，蛋白質(zhì)解吸的程度要低得多。因此，在這一過程中，系統(tǒng)可以在頂層富集最具表面活性的蛋白質(zhì)，而在界面下方可能形成第二層的表面活性較低的蛋白質(zhì)則被耗盡。此外，為了將這些與歧化穩(wěn)定性聯(lián)系起來，我們選擇應(yīng)用大變形膨脹流變學(xué)，并已建立和驗(yàn)證了歧化的理論聯(lián)系[8,9,21]。我們的最后一步是評(píng)估混合蛋白質(zhì)溶液的泡沫形成和泡沫歧化穩(wěn)定性，并嘗試將泡沫特性與吸附層和鋪展層的表面膨脹流變性相關(guān)聯(lián)。

2.材料和方法

2.1.材料

II類疏水蛋白HFBII（分子量7200 Da）從芬蘭VTT生物技術(shù)公司獲得，并從里氏木霉中提取[22,23]。儲(chǔ)備溶液儲(chǔ)存在冰箱中，使用前解凍、稀釋并在超聲波浴中處理30秒。在朗繆爾槽實(shí)驗(yàn)中，乳清蛋白分離物“Bipro”來自Davisco（美國(guó)），其中大部分（約50 wt%）為乳球蛋白。黃原膠Ketrol RD是從CPKelco（美國(guó)圣地亞哥）購(gòu)買的。

2.2.方法

2.2.1.使用朗繆爾槽的小變形和大變形膨脹表面流變學(xué)

對(duì)于空氣/水表面的表面膨脹流變學(xué)實(shí)驗(yàn)，我們使用了Kibron Inc.（芬蘭埃斯波）生產(chǎn)的MicroTroughX Langmuir槽。席胡氏的尺寸為230×55毫米（A＝11800平方毫米），亞相體積約為15 mL。表面張力是用超靈敏的KiBron傳感器、小直徑（0.51毫米）特殊合金絲在槽的中部測(cè)量的。靈敏度優(yōu)于0.01mn/m。

對(duì)于擴(kuò)散系統(tǒng)，制備了1 mg/ml HFBII和1 mg/ml WPI的儲(chǔ)備溶液，并按不同的混合比例混合。廣泛清潔朗繆爾槽后，向槽中注入約15毫升清潔去離子（微孔）水，在真空下脫氣，屏障設(shè)置為3000 mm2。用注射器清潔屏障之間的界面后，表面擴(kuò)大到10000 mm2。將表面張力探針應(yīng)用于界面并進(jìn)行校準(zhǔn)。使用干凈的10μl帶針頭的玻璃微注射器，將約2μl的等分蛋白質(zhì)溶液涂抹在表面的幾個(gè)點(diǎn)上，直到涂抹總體積為15μl。在傳播蛋白質(zhì)的同時(shí)，表面壓力通常上升到大約1到3 mN/m。在平衡表面15分鐘后，以5 mm/min的線速度將面積壓縮至3000 mm2，同時(shí)記錄表面張力隨時(shí)間的變化。隨后，使用滯后函數(shù)，在5至30 mN/m的表面壓力之間（或根據(jù)系統(tǒng)允許的范圍進(jìn)行微調(diào)）施加5次膨脹-壓縮循環(huán)。對(duì)于混合體系，每個(gè)分子的面積定義為槽面積除以所有WPI和HFBII分子的總和，并按其應(yīng)用的質(zhì)量進(jìn)行稱重。從吸附層上拍攝照片，可以看到褶皺的形成。

為了進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，制備了0.1 mg/ml HFBII和0.1 mg/ml WPI的儲(chǔ)備溶液，并將其混合到幾種混合比例。廣泛清潔朗繆爾槽后，用5毫升移液管小心地在3000 mm2的屏障之間填充20毫升蛋白質(zhì)溶液。請(qǐng)注意，它試圖從屏障外部填充，以確保屏障內(nèi)部的初始界面干凈，但HFBII的存在會(huì)在穿過屏障時(shí)產(chǎn)生褶皺。用注射器清潔屏障內(nèi)部的界面后，表面以140 mm/min的速度膨脹至10000 mm2，同時(shí)記錄表面張力。然后讓表面堆積1000 s，然后以5 mm/min的線速度壓縮至3000 mm2。再次膨脹至10000 mm2后，在表面壓力的最大可能范圍（例如，純HFBII為20–40 mN/m，純WPI為15–25 mN/m）之間開始5個(gè)周期的滯后函數(shù)。

使用內(nèi)部開發(fā)的軟件工具計(jì)算膨脹模量。該工具首先通過使用N階切比雪夫多項(xiàng)式對(duì)測(cè)量的П-A曲線進(jìn)行分割和平滑，從而對(duì)其進(jìn)行粗略的縮減。然后使用解析樣條導(dǎo)數(shù)表達(dá)式對(duì)模量進(jìn)行數(shù)值計(jì)算，使我們能夠計(jì)算沿實(shí)驗(yàn)П–A曲線的任意點(diǎn)處的膨脹模量。

2.2.2.發(fā)泡實(shí)驗(yàn)

250毫升燒杯裝有偏心軸，以支撐磁性攪拌裝置Nespresso Aeroccino milk frothing whisk（荷蘭當(dāng)?shù)厣痰曩?gòu)買），該裝置與恒壓直流電源相連，以避免因電池放電而導(dǎo)致功率和再現(xiàn)性損失。

在泡沫實(shí)驗(yàn)中，制備了1 mg/ml HFBII和1 mg/ml WPI的儲(chǔ)備溶液。將儲(chǔ)備溶液在燒杯中按所需比例混合，使總樣品體積為100 ml。在1600 rpm下攪拌樣品6 min。由于泡沫產(chǎn)生后粘度增加，攪拌器偶爾會(huì)從主軸上跳下，但速度始終達(dá)到1500–1600，持續(xù)6分鐘，但有時(shí)會(huì)中斷。排水1分鐘后發(fā)現(xiàn)溢出。將20 ml泡沫層樣品與0.5%黃原膠溶液混合至50%的氣相體積，并使用Turbuscan（TLab Expert，F(xiàn)ormulation，Toulouse，F(xiàn)rance）[8]實(shí)時(shí)跟蹤氣泡大小的變化約48小時(shí)。